牛乳含有豐富優(yōu)質(zhì)全價(jià)的營養(yǎng)成分,是易消化吸收的天然食物。其中蛋白質(zhì)含量為30～35g/L,大約80%為酪蛋白(26g/L),其余的20%為乳清蛋白(6g/L)。酪蛋白是在20℃的條件下將脫脂乳用酸調(diào)節(jié)pH4.6時(shí)沉淀的蛋白質(zhì)。酪蛋白的主要成分是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白。它們在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在著顯著的差異且具有廣泛的用途,如用于開發(fā)嬰兒配方乳,生產(chǎn)酪蛋白源生物活性肽,生產(chǎn)出功能特性更強(qiáng)的蛋白質(zhì),優(yōu)化奶酪和奶酪風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)過程等。由于酪蛋白分級分離產(chǎn)物的功能眾多,其分離純化制備工作也是關(guān)注的焦點(diǎn),本文的目的就是以干酪素為原料,研究酪蛋白分級分離的方法,以期將酪蛋白主要成份αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分離制取,使酪蛋白的使用領(lǐng)域增大,實(shí)用性增強(qiáng)和產(chǎn)品附加值提高并有利于各種乳及乳制品的深加工和資源利用。實(shí)驗(yàn)主要由四個(gè)部分組成。 第一部分,以SinoChrom 300A C8柱為分離柱,建立了高效液相色譜法測定酪蛋白組分的方法。結(jié)果表明,干酪素樣品用含2%巰基乙醇和1%的檸檬酸鈉的7M的尿素溶液處理后,以水(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為0.1%TFA)和乙腈(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為0.1%TFA)分別為流動(dòng)A相和B相,在梯度洗脫流速1. 0mL/min,檢測波長214nm條件下,酪蛋白組分能被有效分離且具有較大的響應(yīng)值,線性關(guān)系良好,峰面積和保留時(shí)間具有良好的穩(wěn)定性,加樣回收率較好,建立的方法切實(shí)可行。 第二部分,以Q-Sepharose Fast Flow為離子交換介質(zhì),以干酪素為原料,對其直接用于酪蛋白組分的分離進(jìn)行了研究。首先確定了其吸附pH,吸附容量,接著討論了流速,洗脫程序?qū)Ψ蛛x的影響,最終結(jié)果為流動(dòng)相:A相為含4M尿素、0.5%ME,pH8.0的20mM的Tris-HCl緩沖液,Β相為含2M氯化鈉的A相溶液,pH仍為8,洗脫流速1ml/min,檢測波長280nm。以分步洗脫為洗脫方式,該洗脫程序能夠?qū)崿F(xiàn)各酪蛋白的初步富集,并為進(jìn)一步的分離打下基礎(chǔ)。 第三部分,研究了尿素沉淀法分離酪蛋白的條件,分析了尿素濃度、酪蛋白濃度、沉淀溫度對分離的影響。先進(jìn)行單因素試驗(yàn),再在各單因素最佳水平值的基礎(chǔ)上,通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了溫度、酪蛋白濃度、尿素濃度這幾個(gè)因素的最佳水平值組合得沉淀溫度40℃,酪蛋白濃度6%,尿素濃度3.2mol/L。然后將尿素沉淀法與離子交換層析法接合對干酪素進(jìn)行分級分離,最終得κ-酪蛋白的相對純度57.3%,回收率49.8%;αs-酪蛋白相對純度75.4%,回收率73.8%;β-酪蛋白相對純度87.9%,回收率62.0%。 第四部分,以離子交換層析后的αs-酪蛋白部分的收集液為例,利用交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-25進(jìn)行了凝膠過濾脫鹽操作,以含40mM碳酸氫氨的pH為8的溶液為流動(dòng)相,從上樣體積和洗脫流速進(jìn)行討論,得最佳上樣量為3ml,最佳洗脫流速4ml。該層析過程能有效的去處離子交換層析中引入的鹽分,且快速方便,非常有利于提高分離效率和節(jié)約分離時(shí)間。

作者：佚名　　來源：知網(wǎng)空間